JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒說明書

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產品詳情

使用方法

使用方法

1. JC-1染色工作液的配制：

取適量JC-1 (200X)，按照每5µl +995 μl JC-1緩沖稀釋液（1X）的比例稀釋至1X JC-1染色工作液。

注：試劑盒標配JC-1緩沖稀釋液為10X，使用前用三蒸水稀釋至1X使用，配置前應于37℃水浴至室溫后方可使用，以免稀釋液過冷染色過程對細胞有刺激影響實驗結果，稀釋時將JC-1緩沖稀釋液（1X）快速加入到200X的JC-1母液中稀釋效果更佳。一般建議6孔板每孔使用JC-1染色工作液量為1ml，其它培養器皿用量以此類推。對于細胞懸液每5-10*10⁶細胞加0.5ml JC-1染色工作液（1X）。

2. 陽性對照組：

該試劑盒包含陽性對照CCCP（10 mM），CCCP可以誘導細胞線粒體膜電位變化。使用方法：用細胞培養液配制CCCP，推薦終濃度為10 µM，對于不同細胞CCCP濃度可自行調整。正常條件下，10 µM CCCP處理20分鐘后線粒體的膜電位會明顯改變，此時，JC-1染色后可觀察到明顯的綠色熒光；相反，正常的細胞經JC-1染色后顯示紅色熒光。

3. 懸浮細胞處置：

a) 取5-10*10⁶細胞，用0.5 ml細胞培養液重懸細胞。

b)加入0.5 ml JC-1染色工作液，顛倒數次混勻。置于細胞培養箱中37℃孵育20-30分鐘；不同細胞根據實驗可自行調整染色時間。

b) 孵育結束后，700g 4℃離心，收取沉淀細胞。

c) 用JC-1緩沖稀釋液（1X）洗滌2-3次：加入1 ml JC-1染色工作液重懸細胞，隨后用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可用流式細胞儀分析。

4. 貼壁細胞處置：

a) 6孔板貼壁細胞處理過程如下：首先，棄培養液，用常溫PBS或培養液輕洗細胞2次，加入1 ml新鮮細胞培養液。陽性對照組中加入CCCP（終濃度10 µM）提前置于孵箱中處理20-30分鐘；

b) 隨后，加入1 ml JC-1染色工作液，充分混勻。置于培養箱中37℃孵育30-60分鐘不等（可根據實驗情況調整）。

d)  孵育結束后，棄上清，用JC-1緩沖稀釋液（1X）洗滌細胞2次。

e)  加入1 ml細胞培養液，于熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。

5. 純化的線粒體：

a) 1 ml染色體系包含：0.9 ml JC-1染色工作液+0.1 ml純化的線粒體 (10-100µg)；置于37℃孵育20-30 分鐘，期間可上下顛倒孵育液，使染色更加均一且充分。

b) 孵育結束后，可用熒光分光光度計或熒光酶標儀檢測：熒光分光光度計檢測：激發波長為485 nm，發射波長為590 nm。熒光酶標儀檢測時，激發波長可在475-520 nm范圍內設置。具體可參考步驟6中的條件進行熒光檢測。

c) 用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同步驟6。

6. 熒光檢測與數據分析：

JC-1單體的激發波為490 nm，發射光波長為530 nm；JC-1聚合物，激發波長為525 nm，發射波長為590 nm。實際測試過程中，可依據實驗室儀器的相關參數進行設置，不必把激發和發射波長設置在最大激發波長和最大發射波長。熒光顯微鏡或共聚焦觀察時，JC-1單體的檢測可參照其它綠色熒光時的設置，如GFP或FITC通道；同理，JC-1聚合物的檢測時可以參考其它紅色熒光，如碘化丙啶或Cy3的設置。因此，出現綠色熒光說明線粒體膜電位下降，我們可以通過比較紅綠熒光的相對比例衡量線粒體膜電位的變化。

注意事項

1.  JC-1 (200X)母液使用時需等待全部溶解后使用。

2. JC-1緩沖稀釋液使用時須0.2μm濾膜進行無菌處理，以防微生物污染影響染色效果。

3. 洗滌時也可以用Hanks' Balanced Salt Solution、PBS等替代JC-1緩沖稀釋液。

附錄：

圖1. 使用本試劑盒檢測A549細胞在正常和造模前后的線粒體膜電位的實驗效果圖。

正常A549細胞經JC-1染色后以聚合物形式存在，呈明亮的紅色熒光，綠色熒光很弱；使用CCCP（10 μM）誘導使線粒體膜電位下降后，JC-1以單體存在形式居多，因此線粒體內紅色熒光強度顯著降低，而綠色熒光顯著增強。

4.為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

5.本產品主要用于科研領域，不宜用于臨床診斷或其他用途。

運輸及保存方法

JC-1 (200X)母液需 -20℃避光保存，避免反復凍融。JC-1緩沖稀釋液4℃保存，至少2周內有效。