worthington磷酸酶

磷酸酶，堿性測(cè)定

分析（雞腸酶）

方法：磷酸酶活性的測(cè)定是基于Brandenberger和Hanson（1953）和Hofstee（1954）的工作。確定了該酶對(duì)鄰羧基苯基磷酸酯的初始水解速率的催化作用。與磷酸酯不同，水楊酸大吸收約300 nm的光。因此水解率可以通過吸光度的增加來確定。在規(guī)定的條件下，一個(gè)單元在25°C和pH 8.8下每分鐘水解一微摩爾的鄰羧基苯基磷酸酯。

試劑種類

• 0.1 M Tris·HCl，pH 8.5
• 0.2 M甘氨酸，pH 8.8
• 0.05 M氯化鎂
• 3.65 mM鄰羧基磷酸苯酯（OCPP）

酵素

以1 mg / ml的濃度溶于0.1 M Tris-HCl，pH 8.5（原液）中。活化后可能需要進(jìn)一步稀釋。

程序

通過在25°C水浴中將mg / ml溶液孵育20-30分鐘來激活酶。

將分光光度計(jì)調(diào)節(jié)至300 nm和25°C。

移液到每個(gè)比色皿中，如下所示：

在分光光度計(jì)中于25°C孵育3-4分鐘，以達(dá)到溫度平衡并確定空白速率（如果有）。加入0.1 ml的原液并記錄從曲線的初始線性部分增加A / ₃₀₀。

計(jì)算方式

分析（大腸桿菌酶）

方法：該方法是Garen和Levinthal（1960）的方法，其中通過測(cè)量由對(duì)硝基苯基磷酸酯水解為對(duì)硝基苯酚而導(dǎo)致的410 nm吸光度的增加來確定反應(yīng)速度。在規(guī)定的條件下，一個(gè)單元在25℃，pH 8下每分鐘釋放一微摩爾對(duì)硝基苯酚。

試劑種類

• 1.5 MTris⋅HCl緩沖液，pH 8.0
• 0.003 M對(duì)硝基苯基磷酸酯（PNP）。必須謹(jǐn)慎使用分析級(jí)和正確的分子量。

酵素

在試劑級(jí)水中稀釋，以獲得0.02-0.04ΔA/分鐘的速率。

程序

將分光光度計(jì)調(diào)節(jié)至410 nm和25°C。

移液到每個(gè)比色皿中，如下所示：

充分混合并在分光光度計(jì)中孵育4-5分鐘，以達(dá)到溫度平衡并確定空白率（如果有）。加入0.1毫升稀釋的酶并記錄。從曲線的線性部分確定3-5分鐘的A ₄₁₀。

計(jì)算方式

分析（小腸酶）

方法：在37°C，pH 9.8下，每分鐘可水解1 umole的對(duì)硝基苯酚磷酸酯。

試劑種類

• 1.0 M二乙醇胺和0.05 mM MgCl ₂緩沖液，pH 9.8：用試劑級(jí)水稀釋12.4 gm二乙醇胺（85％）。加入0.05 ml MgCl ₂溶液（見下文），并用HCl將pH調(diào)節(jié)至9.8（在37°C下）。用試劑級(jí)的水調(diào)節(jié)至100 ml。
• MgCl ₂溶液：將20.3 g MgCl2°6 H2O溶于100 ml試劑級(jí)的水中。
• 0.67 M磷酸對(duì)硝基苯酯溶液：將250 mg磷酸對(duì)硝基苯酯鈉鹽溶于1.0 ml試劑級(jí)的水中。
• 稀釋劑：0.1 M TEA·HCl。將1.86克TEA·HCl溶于試劑級(jí)的水中，添加0.1毫升MgCl ₂溶液和0.1毫升0.1 M ZnCl ₂，用NaOH調(diào)節(jié)pH到7.6，然后用試劑級(jí)的水調(diào)節(jié)到100毫升。

酵素

使用稀釋劑獲得大約0.05-0.06 u / ml。在室溫下靜置15-20分鐘。

程序

將分光光度計(jì)調(diào)節(jié)至405 nm和37°C。

移液到試管中：

混合。測(cè)量吸光度的變化，并根據(jù)曲線的線性范圍計(jì)算ΔA/ min。

計(jì)算方式