抗體亞型的鑒定

亞型指的是相同的構(gòu)成方式，但是空間結(jié)構(gòu)不同的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。抗體亞型，指的是在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的“Y”構(gòu)型的免疫球蛋白（Ig），基于小分子多肽結(jié)構(gòu)上的差異，可以進(jìn)一步的進(jìn)行細(xì)分。

抗體亞型

重鏈

抗體以一個(gè)或者多個(gè)“Y”字形單體存在,每個(gè)“Y”字形單體由 4  條多肽鏈組成,包含兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈。 通常，抗體的種類由重鏈決定。例如哺乳動(dòng)物 Ig 的重鏈一共有五種,分別用希臘字母α、δ、ε、γ和 μ 來命名,相對(duì)應(yīng)組成的抗體就稱為  IgA、IgD、IgE、IgG   和   IgM。其中，人的γ可以進(jìn)一步細(xì)分為γ1、γ2、γ3、γ4 等亞類，分別對(duì)應(yīng) IgG1, IgG2, IgG3 和 IgG4 四個(gè)亞型，小鼠γ可以進(jìn)一步細(xì)分為γ1、γ2a、γ2b、γ3 等亞類，分別對(duì)應(yīng) IgG1, IgG2a, IgG2b 和 IgG3 四個(gè)亞型。

輕鏈

哺乳動(dòng)物有兩種輕鏈：λ型和κ型。出于科研的需要，人們也會(huì)對(duì)輕鏈的亞型進(jìn)行鑒定。

表1   不同亞型抗體的結(jié)構(gòu)與功能

抗體亞型鑒定

抗體亞型鑒定的原理是利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA），測(cè)定待測(cè)抗體與不同亞    型特異性的抗體的結(jié)合情況，找出可以與待測(cè)抗體特異性結(jié)合的抗體，由于與待測(cè)抗體結(jié)合的抗體的特異性都是已知的，依據(jù)結(jié)合抗體的特異性可以得出待測(cè)抗體的亞型。以小鼠抗體亞型的測(cè)定為例，利用 ELISA 測(cè)定待測(cè)抗體與針對(duì)小鼠 IgG1、

IgG2A、 IgG2B、 IgG3、IgM、λ、κ有特異性的抗體的結(jié)合情況。如果待測(cè)抗體抗體可以與針對(duì)小鼠 IgG1 的特異性抗體結(jié)合（通過肉眼觀察顏色深淺或通過測(cè)

OD 值判斷），則該抗體的亞型為 IgG1。以此類推，也可以測(cè)出輕鏈的亞型。

鑒定方法

目前比較常用的方法是利用試劑盒進(jìn)行抗體亞型的鑒定，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，便可以直觀的讀出抗體的亞 型。

利用試劑盒鑒定抗體亞型常見問題與解決方法：

樣本中抗體濃度過高再將樣本 1:2-1:10 稀釋

抗體亞型鑒定的意義

表 2：常見問題與解決方案

不同亞型的抗體在結(jié)構(gòu)上有所區(qū)別，其免疫源性與在體內(nèi)發(fā)揮的作用存在差異，對(duì)抗體進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)分，并進(jìn)行        抗體亞型鑒定，對(duì)于疾病作用機(jī)理的研究、抗體藥物的開發(fā)有重要意義。

推薦產(chǎn)品：

品牌：antagen/ Antagen Pharmaceuticals

貨號(hào)：ISO-M8a

20個(gè)測(cè)試（測(cè)試16.50美元）Cat＃ISO-M8a-20

10個(gè)測(cè)試（測(cè)試19美元）Cat＃ISO-M8a-10

5個(gè)測(cè)試（每個(gè)測(cè)試21美元）Cat＃ISO-M8a-5

小鼠同種型試劑盒 - 快速小鼠抗體同種型XpressCard（ISO-M8a）

ISO-M8a：每個(gè)試劑盒包含兩個(gè)盒，一個(gè)用于IgG1，IgG2a，IgG2b和IgG3，另一個(gè)用于κ，λ，IgA和IgM。

效益：

快速小鼠免疫球蛋白同種型試劑盒是一種5分鐘的側(cè)流測(cè)定，具有ELISA敏感性，可用于單克隆抗體類別和亞類測(cè)定。它可以在一個(gè)快速測(cè)試中確定IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA和IgM，以及κ，λ。

可接受的樣品類型：

包括雜交瘤培養(yǎng)上清液和純化的單克隆抗體。不推薦腹水，因?yàn)樗ǔ：卸喾N免疫球蛋白。然而，該試劑盒仍可用于確定腹水液樣品中主要同種型的相對(duì)分布。

套件組件：

同種型試劑盒具有三種不同的大小，每個(gè)小袋含有兩個(gè)盒子的5,10或20個(gè)小袋：一個(gè)盒子用于測(cè)定IgG1，IgG2a，IgG2b和IgG3，另一個(gè)盒子用于測(cè)定κ，λ，IgA和IgM。兩個(gè)條帶都包含一條控制線。

注意：

BALB / c和DBA小鼠產(chǎn)生IgG2a，而不是IgG2c。但是C57BL / 6，C57BL / 10，SJL和NOD產(chǎn)生IgG2c，而不是2a *。

1）將盒式磁帶放在水平面上。

2）將80-100μL抗體溶液直接加入樣品孔中。等待5分鐘。

3）在對(duì)應(yīng)于抗體特異性同種型的位置處的紅色測(cè)試線和在“C”位置處的紅色對(duì)照線將在1-5分鐘內(nèi)出現(xiàn)。

該測(cè)定  比傳統(tǒng)的ELISA方法更快 更方便。

結(jié)果解讀： 

1.結(jié)果無效：“C”處沒有紅線。

2.否定結(jié)果：“C”處只有一條紅線。

3.積極成果：

一個(gè)）。單一單克隆抗體：除陽性對(duì)照“C”系外，僅出現(xiàn)一條重鏈和一條輕鏈。

B）。多種單克隆抗體：除陽性對(duì)照系外，還會(huì)出現(xiàn)一條以上的重鏈和/或輕鏈。線強(qiáng)度可用于判斷顯性同種型。

表現(xiàn)：

低檢測(cè)限為100 ng / m。每種同種型之間沒有交叉反應(yīng)性。

存儲(chǔ)：

在室溫下將條帶存放在原始包裝中。從認(rèn)證日期起，該產(chǎn)品可穩(wěn)定長(zhǎng)達(dá)18個(gè)月。不建議凍結(jié)條帶。

抗體亞型鑒定常見問題解析

一、單抗亞型鑒定(亞型,單抗,腹水,陽性克隆)
篩選出陽性克隆后，制備了腹水，可是鑒定亞型的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)亞型不純，有好幾種，不知道是什么原因。亞型鑒定選用的是SBA的亞型分選試劑盒。腹水沒有純化，離心后直接測(cè)得。請(qǐng)大家?guī)臀曳治鲆幌率鞘裁丛颍?/span>
答：你要測(cè)亞型必須用細(xì)胞培養(yǎng)上清或者是純化后的抗體，不能用腹水：腹水的成分很雜，包含小鼠本身的IgG。另外還有可能是你的細(xì)胞株本身就不是單克隆，SBA的亞型試劑盒我沒有用過，我用過sigma的是ELisa方法測(cè)定亞型，很不好用。用serotec試紙條或bethly免疫擴(kuò)散效果很好；HBT的試紙條也不錯(cuò)，操作簡(jiǎn)單，2-3小時(shí)搞定，推薦用細(xì)胞上清來檢測(cè)，不易出現(xiàn)多亞型誤檢。缺點(diǎn)是價(jià)格偏高；謝謝了。從大家的分析來看亞型不純由以下原因產(chǎn)生：1.腹水需要純化后再測(cè)亞型。2.單克隆篩選不純。
二、單抗亞型鑒定為何全部是IgM
在小鼠免疫階段，是按照經(jīng)典方法進(jìn)行免疫的：經(jīng)過基礎(chǔ)免疫，三次加強(qiáng)免疫（間隔三周），小鼠效價(jià)達(dá)到1：12800以上，末次沖擊免疫三天后，取脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，然后根據(jù)間接ELISA檢測(cè)效價(jià)上清結(jié)果和有限稀釋法進(jìn)行篩選和亞克隆，其中的酶標(biāo)二抗用的是辣根酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG（Fc片段），三輪亞克隆后得到五銖全陽株，可是經(jīng)過取他們的細(xì)胞上清進(jìn)行亞型鑒定結(jié)果全是IgM。

三、抗體的亞型選擇、恒定區(qū)序列改造-分子設(shè)計(jì)考慮
在抗體藥物中IgG有4個(gè)亞型，本身具有的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)如Hinge序列及原本功能特點(diǎn)使其治療應(yīng)用上有較大區(qū)別。另外目前基因工程使得改造變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。
IgG3由于其半衰期比較短并且hinge區(qū)域易水解，限制其在藥物中應(yīng)用，但是也有文獻(xiàn)提到做融合蛋白時(shí)增大柔性時(shí)會(huì)考慮使用。
需要ADCC和CDC效應(yīng)的，優(yōu)先選擇IgG1，并且有細(xì)胞株敲除巖藻糖，使得ADCC效應(yīng)增強(qiáng)，例如CD20抗體；
如果只是阻斷抗體，不需要ADCC和CDC效應(yīng)，優(yōu)先選擇IgG4，例如目前國(guó)外獲批上市的PD-1抗體（Keytruda、Opdivo），均為IgG4，并且進(jìn)行了S228P改造。IgG4存在的問題是容易形成半抗體（發(fā)生Fab-arm的交換），S228P的突變就是降低Fab-arm的交換。
目前也有部分抗體采用IgG2的，主要也是低ADCC和CDC效用。
IgG1亞型的選擇這個(gè)話題很有意義，IgG1其實(shí)是現(xiàn)在成熟的，研究多的。IgG4亞型在近幾年應(yīng)用也慢慢增多，IgG4在通過S228P突變解決Fab-arm exchange后還有一個(gè)問題，就其穩(wěn)定性不好，但是現(xiàn)在有很多成藥的都在用IgG4，例如PD-1等等，不知道這一塊如何解決？在制劑上下功夫？
關(guān)于IgG2這個(gè)成藥的幾乎，主要因?yàn)镮gG2的二硫鍵錯(cuò)配問題，IgG2的二硫鍵遠(yuǎn)比IgG1和IgG4的復(fù)雜，如果想用IgG2亞型就得考慮二硫鍵的問題。
根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，IgG4 Fc對(duì)于pH非常敏感，低pH時(shí)候非常容易發(fā)生沉淀（聚集），然而高pH容易發(fā)生脫酰胺。
糖基化對(duì)于抗體穩(wěn)定性確實(shí)有比較大的影響，我們IgG4 Fc是在E.Coli表達(dá)的，從長(zhǎng)期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)來看，好像影響不大（可能case by case），或許象你說的，去糖基化會(huì)對(duì)pH變得更加敏感。
制劑方面，我們重點(diǎn)考察了pH范圍以及緩沖體系，避免聚集的發(fā)生
IgG4 Fc的Deamidation導(dǎo)致酸性峰增加，其主要原因可能是由于pH導(dǎo)致的。我們采用LC-MS/MS方法，鑒定結(jié)果顯示酸性峰deamidation位點(diǎn)主要是NG和NS（G和S都是屬于空間位阻較小的氨基酸）:
- EEQFNSTYR
- VVSVLTVLHQDWLNGK
- GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK
上面是我們項(xiàng)目的數(shù)據(jù)，主要位于CH2區(qū)域，僅供大家參考。對(duì)于ADCC、FcRn、PK和免疫原性沒有深入研究過，但是由于脫酰胺在人體中可天然發(fā)生，免疫原性應(yīng)該不會(huì)有問題。